泉源 | “Ayumi的癫狂”的微博刚刚（2021年1月19日）在Cell Research上线了一篇文章，Direct control of store-operated calcium channels by ultrafast laser，我们实现了用激光直接特异性地控制细胞SOC钙离子通道，而不需要光遗传技术。我们给出了完整的分子机制，以及在多个细胞系和在体水平上（不开颅的活体小鼠大脑的神经元）上实现了调控。这个事情实验上做了四年多，揭晓拖了两年，历程极其崎岖艰辛，记载如下。这篇文章是我的学生程攀和田晓莹为焦点做的。
最开始是程攀刚刚本科毕设的时候，在我这里做了一些简朴的预实验，主要是用飞秒激光刺激细胞，看钙信号的变化。那时我刚开始在交大建实验室，其实就是在测试系统性能，我想着本科生毕设刷一篇BOE或者APL也挺酷炫，就设计了一个套路化的思路让他去做，很快拿到了一些简朴的数据。我注意到细胞的钙上升对飞秒光的波长极其敏感，其时他在700，800，和1000 nm各测了一组点，同样的钙内流需要激光的功率相差到达20倍以上。
我很是惊讶，让他进一步测整个700-1000 nm的光谱。为了保证数据公正可靠，每次丈量前我们都要对系统和细胞举行工程上的calibration，整个历程异常枯燥琐碎，程攀也多次诉苦，不外幸亏他坚持了下来。当整个光谱（就是最后的Fig. 2a）展现出来的时候，我知道事情一定很庞大，细胞对激光波长的敏感性到达了令人震惊的水平，这绝不是一个简朴的多光子引发历程——它对波长不敏感，而是有某个分子到场其中。
我其时想不到会是离子通道，而是推测是细胞内的某个分子。由于光谱（其实是个残缺的谱，700 nm以下的数据至今也没有拿到）峰值在700 nm，对应的双光子吸收特征分子最可能的是NADH。
我请教了学院的NADH专家殷老师，他推测线粒体-ROS会是主因。我心中异常失望，因为这是一个很是无趣且没用的机制。我让程攀丈量了线粒体的膜电位、ROS等所有指标，并使用了一大堆ROS的scavenger，效果再次出乎意料，线粒体的指标在整个钙内流历程中没有变化，mitoROS也没有变化。实验走上了死路，但也意味着新的时机。
其时我在和程宁静院士有一个简朴的互助，我帮他们做一个飞秒激光准确调治线粒体状态的技术工具，恰好程院士来上海开会，我去找他劈面讨论了我现在这个事情。程老师很是认真地听了我所有的效果和推测，但他依然说“除了NADH，不会有此外可能”。我心中再次极端失望。
然而我和殷老师互助的时候，帮他测到了一个皮肤自荧光的现象，在分析数据的时候，我查了大量的分子光谱的论文，发现flavin在700-800 nm波段具有很是好的双光子吸收峰。那么会不会是flavin？为了验证这个思路，我设计了一个其时感受很是精巧厥后看来比力低效率的实验，就是在双光子引发后丈量flavin的自荧光变化。这次猜对了，激光引发区域的flavin自荧光泛起了显著性下降，而且激光引发钙内流的效率与细胞自己的flavin水平出现极高的相关性。
固然，我其时是思路依然绕着线粒体在打转转。于是我们连忙去费了很大劲调了细胞的flavin水平，包罗用RNA调治FAD的酶，使用RF以及FAD造就细胞等。效果显示，flavin很是重要。
然而，这些效果却一直和线粒体-ROS没有什么关联。我们做了一个精致的观察钙内流的实验，而且用了一大堆种种荧光卵白去visualize钙内流在各个亚细胞结构中流传的历程，发现这个历程是从细胞膜上开始了。
所以是离子通道？整个钙内流的历程是缓慢的，最疑似的莫过于SOC通道，固然另有TRP通道。程攀争辩说并不能清除细胞内的诸如RYR，细胞膜上的P2X，P2Y等。幸亏验证SOC是我的老本行，我们筛选了一大堆离子通道抑制剂，做了TRP和TRPC的清除，做了经典的add back实验，并用siRNA调了Orai1的水平。这些效果让我心中已经九成相信，就是SOC。
于是整个实验历程中最难题的一步来了，钙内流光谱和flavin相关，钙内流历程与SOC相关，flavin和SOC是八竿子打不着的工具啊，这tmd是啥原因。我们整天都在苦苦查论文寻找灵感，我作为一名极端灰心主义者，程攀更是，我们一度自我怀疑我们的数据有问题。但我外貌上装作信心很足，先不管机制，继续往前做。
于是我们先做了一个Orai1的分子动态表征，观察了Orai1在激光引发的历程中（这个历程很短，最快只需要63 ms）的聚集现象，并用这个现象进一步给出了一些机制上的效果。我希望能进一步丈量SOC活化的膜片钳数据，这是离子通道验证的金尺度。我们四处探询那里有搭载膜片钳的双光子系统，但一无所获。就在计划放弃了开始写论文投个BOE的时候，一个转机泛起了。
程攀告诉我，他刚刚听了一个陈诉，Leica公司邀请了中科大的鲍进老师讲双光子系统，他会后找鲍老师谈天，发现他们那儿有这个系统。我连忙联系了鲍老师，问能否到他们那里做个实验，鲍老师和我讨论了一些细节之后就允许了，我又进一步联系了他们实验室主任也是中科大生科院院长，我的校友学长薛天教授。薛老师也很nice地允许没问题。
既然要已往，只做一个实验性价比不足，我又查了薛老师的事情，发现他们那里还可以看脑片，于是又设计了一个in vivo的demo实验，鲍老师说没问题。我带着程攀去了合肥，住在科大西区门口的一个破宾馆里。
这是我本科结业十年后第一次回母校，没想到是去做实验的。在已往的路上，我们依然在讨论可能的机制，到科大的时候已经是晚上，我和鲍老师约好第二天一早去实验室。
我带程攀吃了我影象中的小马烧烤，感受味道下降了许多，但他作为一个上海念书的土包子，依然震惊于味道居然这么好。吃过饭，我们各自回房间查文献。我依然记得那天晚上，破晓一点多，程攀问我，贺老师睡了吗？我说没有。
他说那你来我房间一下，我有重大发现。我已往一看，程攀说他在看光遗传BLUF和LOV体系的时候，有一个经典机制，就是flavin可以和Cys形成硫醚键，我们是否可以参考。我其时刚恰好也在看Orai1的分子结构，我说我知道Orai1上有三个Cys。讨论到了三点多才睡。
一切都存在了理论上的解释。在科大做实验很是不顺利，一方面是在别人的实验室肯定什么都是不顺手的，一方面膜片钳我们都不会，难度也很是大。鲍老师亲自上阵也没解决。
我第二天另有课，就先回了上海，留下程攀继续享受实验和合肥的美食。在鲍老师和薛老师的支持下，我们最终只拿到了一点点膜片钳的数据，不完整。但我们幸运地拿到了脑片的数据，也就是说，我们这个技术是可以在在体水平上事情的。
我又让程攀做了活体小鼠的效果，没想到效果也是出人意料的好。这时时间已经由去了两年多，程攀处于硕士结业的阶段。我就先把整个数据整理完，写了一篇机制上很不完备的论文。
我以为这个事情的焦点在于我们第一次发现了激光是可以直接控制SOC通道的，可以使用细胞内源性的flavin作为感光基团。我把论文发给了science的编辑和nature biotech的编辑看。他们都给了很好的评价，于是我就急忙投了nature biotech，我的dream journal，其时我还数了一下，整其中国大陆以第一单元在nature biotech上发的论文不凌驾10篇。
论文很快送审，那是2017年的暑假，我极端开心，但也很是忐忑，我知道整个事情很是粗拙，毛病百出，没有完整的机制，通篇都是推测，也缺少应用上的验证。2017年10月，我在给本科生上课前收到了nature biotech的邮件，拒稿，但建议修改后重投。四个审稿人，审稿意见写了11页，只有一小我私家给了很高的评价，建议补一些小实验，有一小我私家建议大修，一小我私家建议把机制做完整，另有一小我私家没有看懂，长篇大论说这个肯定是ROS的机制。我看得很是生气，那天整个上课的时候都漫不经心，手都在发抖。
接下来我和学生们认真地把意见一条一条过，一条一条设计实验，基本上除了一个增强在体应用的建议以外，其它的意见我们感受都可以通过实验论证。我又有点开心，先大致写了一个回应给编辑，问他我们或许这样修行不行，编辑简朴地说，加油，我期待看到你们的修改。我们最焦点的机制基本就是在这个阶段完成的，特别是最重要的flavin与Cys联合是否通过thioether bond，以及Orai1通过疏水键联合等等。为了应付所谓应用，我们做了一个很糙的demo，用拮抗剂抑制了脑片的神经元，然后用激光打开。
这个实验其实也很糙的，但我其时陶醉于做出了一种不需要光遗传的光遗传事情的美梦中，没想太多。论文改完，已经是2018年底，投回去没多久，另外几个审稿人表现问题不大了，但之前谁人负面审稿人依然没有被说服，编辑还说你们怎么没有做动物行为学的技术验证呢？再次拒稿。我很是不平，appeal了一次，还是被拒了。
其时心中极其不爽，然后转投了nature methods，很快送审了。我心中再次充斥了希望。然后到了2019年过年之后，nature methods意见出来了， 也是四个审稿人，两小我私家给了很好的意见，都是推荐揭晓，其中一个给的意见很是有建设性，他建议我们划分把三个Orai1上的Cys突变掉，这样就能筛选出来flavin究竟是和哪个Cys联合的。一小我私家给了一些修改意见，比力简朴，一小我私家给了四条意见，刀刀见血，划分是，没有膜片钳，没有行为学，没有与光遗传的技术比力，没有通道唯一性的证明。
编辑出人意料的拒稿，我不平，appeal，再被据。我心中已经充满了绝望。其时程攀已经在学校待到了最后一刻，即将去纽约大学医学院读博。我对审稿意见还是很佩服的，就让第二个学生田晓莹接手。
为了针对审稿意见做实验，我们需要搞到Orai1-KO的细胞。我查论文的时候看到北大的陈良怡教授之前也做过许多Orai1的事情，就抱着一丝希望问他有没有，他说北师大的王友军教授那里有。我联系了王老师，拿到了至关重要的Orai1-KO和Orai1,2,3-KO的HEK293细胞。
为了保险，我们也构建了相应的HeLa细胞。我们在这些细胞上做了Orai1-KO和rescue实验，以及Cys三突变实验，找到了flavin是和C195和C143联合。此外我们也做了FRET实验，直接证明晰Orai1在激光激活后确实是形成了分子键联合。
到了这一步，机制上已经很是完备了，唯一的短板还是应用。我抱着希望投回了nature methods，但编辑没有送审，于是我又转投nature photonics，没想到送审了，很快三个审稿人回来，两个推荐揭晓，一个给了一点小意见，但编辑居然拒稿了。我完全不懂为啥，编辑说这个事情太过于生物，建议你投NCB。
我心情已经糟到了极处，又投了NCB，这个太难，究竟是仅次于cell的大刊，不会理我们这种做方法的。果不其然，论文都没送审就被拒了。
我以为是不是我写得欠好，于是就把论文发给了我的老朋侪，东大的Goda教授。他把我批了一顿，说这个文章要是一早给他来改，绝对早就发了。
我们写得太差。于是在2020年疫情最严重的那几个月，Goda给我改了一轮又一轮的论文，然后他建议我投science advances，究竟被N系杂志拒得满头包，新系统新气象。投给sci adv我是很不爽的，它在我心中是和NC差不多的“水刊”，论文质量良莠不齐。
我心中带着鄙夷投已往，很快送审，但没想到就很快又被拒。我看了审稿意见，基本没怎么读我们的文章，如果写response letter，基本就是给审稿人做科普和反驳。我心中极其不满，写信给编辑把审稿人骂了一顿，我俩在email里往返打骂。
至此我已经感应心力交瘁，Goda教授让我赶快投PNAS。我因为还想着用这篇文章来争取项目，想搞个快的，于是不听他的，把整个nature biotech， nature methods，和nature phtonics的审稿意见以及response letter发给了cell research的编辑李党生教授，问他有没有可能快速送审快速决议。
我记得他以前和我说过，可以这样操作。李博士很是认真地读完所有质料和我们的论文，我知道这个是因为他回信的时候还和我枚举了一堆论文里的一些小错误，和我写的response letter里差池的地方（这一点让我在最黑暗的时刻感应很温暖），和我说可以给我快速送审。于是很快论文送审，四个审稿人，三个建议吸收，一个提了一些简朴的意见，主要还是关于Orai1上的卵白，纷歧定是C，也可能是L。
于是我们又补了这么一个实验，论文终于被吸收。Goda还和我说，这个杂志欠好，是你们中国人的自high，还是PNAS好。
我说PNAS不外是美国佬的自high，我看好国产期刊。这篇论文吸收后很幸运，我收到了优青的答辩通知，也用上了这篇文章，算是获得了利益最大化。
尤其幸运的是，国家真的出台了一大堆政策，来勉励发国产期刊。我以此聊以自慰，发CR总比发NC强。这是一个功利的了局，但并不违背我的初心。
整个事情历程历时四年多，投搞折腾了一两年。这对我的磨炼很是大。
之前投NP的时候似乎过于顺利，我并没有获得许多发展。最近在写论文和设计思路的时候，确实显着感受到游刃有余。希望后面的这几篇文章能顺利一些，也希望我们的国产期刊能挣脱中国人自high的阴影，早日发展起来。
文章链接：https://www.nature.com/articles/s41422-020-00463-9。
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